动物造模,基因敲除 中国实验动物信息网 2022-03-04 1491

　　目的 利用 CRISPR/ Cas9 和 Cre-loxP 技术相结合构建牛磺酸转运体在中枢神经系统中条件性敲除大鼠,并对其脑组织线粒体 mtDNA 及线粒体呼吸链酶活性进行初步研究。

　　方法 利用 CRISPR/ Cas9 和 Cre-loxP 技术获得 TauT 基因第 5 外显子两端含有 loxP 位点的杂合子大鼠(TauTloxP / WT )。 将获得的 TauTloxP / WT大鼠与 Nestin-Cre 大鼠交配,经繁殖和鉴定*终获得神经特异性 TauT 基因敲除大鼠(TauTloxP / loxP / Cre+ )。 通过 Real-time PCR、Westen blot、免疫组化对 TauTloxP / loxP / Cre+大鼠进行基因和蛋白表达检测,用 HE 染色观测其脑组织形态,并对脑组织 mtDNA 拷贝数和线粒体呼吸链酶(Ⅰ/ Ⅱ/ Ⅲ/ Ⅳ/ Ⅴ)活性进行检测。

　　结果 与野生型大鼠相比,TauTloxP / loxP / Cre+大鼠脑组织中 TauT 基因和蛋白表达显著降低,TauT 基因在中枢神经系统被成功敲除,模型构建成功;HE 染色显示 TauTloxP / loxP / Cre+大鼠脑细胞数量和密度有所降低,而老年 TauTloxP / loxP / Cre+大鼠脑中细胞病变更加明显。 此外,与野生型大鼠相比,TauTloxP / loxP / Cre+大鼠脑组织线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性显著降低,但 mtDNA 拷贝数却明显上升。

　　结论 利用 CRISPR/ Cas9 和 Cre-loxP 技术成功了构建中枢神经系统 TauT 基因敲除大鼠模型,并初步验证了此模型对脑组织及其线粒体呼吸链酶和 mtDNA 的影响,为研究牛磺酸及 TauT 对脑组织的分子机制提供了新的模型平台。