动物造模 中国实验动物信息网 2021-10-09 1789

　　所有阿片类药物（吗啡等麻醉镇痛药）都具有成瘾性，包括耐药性和身体成瘾性。耐药性是指随着重复给药，镇痛作用减弱，需要增加药物量以获得*初的镇痛作用。当止痛药突然停止使用时，人和动物就会流涎，呕吐，瞳孔扩大，呼吸困难，剧烈的中枢激动和各种无法忍受的痛苦表情。这些异常的生理和行为功能障碍，称为“戒断症状”或身体依赖性，表明会上瘾。当前，有三种常见的实验方法可用于评估世界上对阿片类药物的物理依赖性。

　　1依赖实验的分类

　　1.1自发性戒断试验（自发性戒断试验）

　　对实验动物（小动物，大鼠，猴子）的连续和逐步给药，停止给药，在一定时间内稳定。服药前的时间。之后，突然停止给药，观察并记录动物的戒断症状。  .1.2沉淀戒断试验

　　在相对较短的时间内，对动物使用了大量的测试药物，然后再使用阿片类药物拮抗剂来促进戒断症状的发展。反应。如果动物具有吗啡样戒断症状，则意味着该研究药物与吗啡属于同一类型。它促进实验性戒断症状，严重和典型症状，并在短时间内迅速发作，从而易于观察和比较。

　　1.3替代测试

　　在一段时间内服用一定量的标准药物（例如吗啡）后，动物会出现身体依赖性。身体依赖性增强后，将停止使用标准药物，而是使用研究药物来观察动物是否表现出戒断症状。替代研究药物后，如果没有戒断症状，则表明两种药物的物理依赖性相似。这种测试也称为跨物理依赖性测试。

　　动物，无论是自然戒断还是强制戒断，都会表现出一系列不同程度的体征或症状，即戒断综合症。但是，并非所有戒断症状或症状都出现在试验动物中。因此，有必要考虑几个指标，以便在不同的动物和不同的实验中全面评估每种症状，例如时间，频率和严重性。

　　1.4戒断症状分级

　　猴子是一种国际公认的实验动物模型，用于评估对阿片类药物的身体依赖性。戒断症状的分级基于对Seevers在1930年代长期连续给药后给予恒河猴的吗啡和海洛因的系统研究。它包括多种戒断症状和自主功能，生理功能和行为改变的症状。

　　1.戒断症状分级（）（1）轻度症状包括恐惧，打哈欠，流泪，震颤，潮红，出汗，哭泣，斗志不合，食欲不振和大便稀疏。 （2）中度动物表现出意向性震颤，食欲不振，直立的头发，肌肉痉挛，腹腔滞留，腹泻，全身不适和卧位。

　　（3）极度的躁动，闭着眼睛躺着，姿势异常，呕吐，面色苍白和明显的肌肉痉挛加剧了严重的症状。

　　（4）非常严重的疲劳（包括面部表情，呼吸困难，严重脱水），体重减轻超过10％甚至死亡。

　　2.评分标准（等级差异和症状点）

　　（1）轻微等级差异为5分，每个症状为3分，在1天之内重复相同的症状，并进行1分倒计时。

　　（2）中度差异为10分，每个症状为4分。如果同一症状在一天内重复出现，则时间将减少1点。

　　（3）严重成绩差异为17分，每种症状5分。如果同一症状在一天内重复出现，则时间将减少1点。

　　3、评分标准

　　评分是基于症状和等级的综合判断。每种症状的分数应有所不同。相同等级的症状数量必须不同，但分数不应超过差异。等级值。

　　三个继发症状等于较高水平的症状评分，例如，三个轻度症状评分（5 + 3×3）=一个中度症状评分（10 + 4）。

　　中度症状为3分（10 + 4×3）=严重症状为1分（17 + 5）。如果动物精疲力竭或死亡，则看不到其他症状，因此给定的分数对应于轻度，中度和重度症状的总和。

　　下面，我们将分别描述常用的动物实验模型。

　　2自发性戒断试验

　　自发性戒断试验是一种慢性实验，其中通常以增加剂量或固定剂量给予研究药物。施用方法可以是注射（皮下，肌内，腹膜内和静脉内），管饲，药物片剂的移植，并且可以通过混合和饮用来施用。

　　2.1小鼠自发戒断试验（小鼠）

　　小鼠主要通过混合和饮水进行给药。将体重为20-22g的雄性和雌性小鼠分为空白对照组，阳性药物对照组和测试药物组。对于阳性药物，可以将盐酸吗啡或可待因粉与粉末混合（盐酸吗啡：1.0 mg/1 g粉末，磷酸可待因：2.0 mg/1 g粉末）并给药7天。在第8天，我们拔出了老鼠，并开始给他们喂食无毒品的饮食。在加油前一天对小鼠称重，在加油后每4小时称重一次，直至恢复正常。计算戒断后每个时间点的小鼠体重减轻百分比，并在各组之间进行t检验。

　　2.2大鼠（大鼠）的自发戒断试验

　　（1）皮下注射体重200-220 g的健康大鼠。每组有10只动物，一半为雄性，一半为雄性。实验动物随机分为阴性对照组，阳性药物对照组和试验药物组，阳性药物为吗啡。吗啡依赖性大鼠模型是通过剂量递增方法形成的，持续时间为1个月。给药方法为每天3次皮下注射吗啡（sc）。对于前两周，模型剂量为5天，10毫克/千克体重，持续4天，15、20 mg/kg体重，持续3天，注射剂量为0.1毫升/ 100克体重。在第3和第4周的剂量分别为30mg /（kg体重？D）。在停用吗啡的前一天给大鼠称重，在停用吗啡后的第29天观察到体重的变化。连续4天每天测量3次体重。计算每组大鼠的平均体重变化率，并进行统计测试以评估研究药物是否在生理上依赖。 （2）健康大鼠摄取混合药物食物，体重200-220g，每组10只动物，雄性一半，雄性一半。将实验动物随机分为阴性对照组，阳性药物对照组和测试药物组。阳性药物可以是盐酸吗啡或磷酸可待因。将受试药物吗啡或可待因混合到粉末中。通常，每克粉末含有1.0毫克的吗啡盐酸盐或2.0毫克的可待因磷酸盐。称重消耗的粉末，每天更换一次。给大鼠喂食混合粉末1周以形成依赖性模型。在第8天，用吗啡或不含可待因的粉末代替大鼠，并且大鼠自发地表现出戒断症状。阳性对照继续接受含有吗啡或可待因的粉末。停药后3天内每4小时对大鼠称重一次。计算每组大鼠的平均体重变化率，并进行各组之间的t检验。

　　从吗啡戒断后，大鼠的体重急剧下降。这在24-36小时*明显，是身体对吗啡依赖性的*好指标。将测试药物组中大鼠的体重与阳性和阴性对照组中大鼠的体重进行比较，以确定身体依赖性的可能性。体重减轻是相对客观，定量，准确的，并且广泛用作身体依赖性的指标。

　　2.3猴子（猴子）的自发戒断研究

　　（1）进入临床之前使用新的止痛药是因为止痛药对猴子的依赖性与人类相似，并且戒断症状更明显且更易于观察，因此这是必要的实验。广西壮族自治区（Rhesus亚种）是常见的动物，体重4-6公斤，每组有3只或3只以上的动物，雄性和雌性。

　　（2）实验方法

　　1）Siever方法有两种基本方法。一种是快速增益法，其中吗啡的初始剂量为每天10 mg/kg体重和10 mg/kg体重。 ..它在大约6周内达到*高115 mg/kg体重，并且在停药后猴子表现出严重的戒断症状。第二个是吗啡剂量，总剂量和6天后迅速增加。 -类似地，超过12个月，即使停药后仍会出现上述戒断症状。

　　2）Yanagta方法是一种改进的Seevers方法。吗啡每6小时皮下注射一次，剂量为3.0 mg/kg体重，并连续给药至少60天，使猴子能够形成吗啡依赖性实验模型。

　　3）全面的方法每天皮下注射吗啡3次，从第1周到第3周维持3、6、10 mg/kg体重，从第4周保持15 mg/kg体重。直到90天。 （3）实验步骤将猴子随机分为阴性对照组，阳性药物对照组和试验药物组。研究药物通常分为三个剂量组。低剂量一般采用临床剂量。对于高剂量组，根据药物的特性选择相应的剂量。上瘾可能性较小的药物应选择接近毒性反应的剂量。*大耐受量；中剂量组的剂量介于高剂量和低剂量之间。研究药物可以恒定剂量或增加剂量给药。每组中的动物连续给药长达90天，并停药。停药后，连续观察患者7天，每天观察3次。记录并称重猴子的各种行为。我们根据戒断症状的程度计算出体重变化率。

　　3 Precipitationwithdrawaltest

　　Precipitationwithdrawaltest的一个重要问题是阿片受体拮抗剂的选择。拮抗剂本身必须非常特异性，没有其他药理作用，并且不干扰戒断症状的评估。通常在胃肠外给予拮抗剂以使戒断反应出现*快，因此它们也*有可能引起戒断反应。

　　3.1小鼠提示戒断测试（小鼠）

　　鼠标提示戒断测试是一种常用的筛选模型，用于评估对阿片类镇痛药的物理依赖性。

　　1.小鼠直立试验（erectthetailtestinice）

　　（1）实验方法是将20-40只14-16 g的小鼠分为两组，并皮下注射吗啡（15 mg/kg体重）给接受者。试试药。给药后十五分钟，吗啡组的动物显示出垂直尾巴，继续行走，并且趋于仅在2-4小时后恢复。在每组动物继续使用该药物后，吗啡组的垂直尾巴现象更加明显。服药14-28天后，剂量增加到44 mg/kg体重。然后，以16mg/kg的体重皮下注射烯丙基吗啡，并分别注射吗啡和受试药物。吗啡动物尾巴上的勃起消失并聚集在一起。这与生理盐水对照组非常相似。与吗啡组平行观察该研究药物组，以观察该动物的外表症状是否被烯丙基吗啡抵抗，并确定其是否为吗啡型药物。例如，四氢巴马汀已被证明不属于吗啡类型。

　　再取40只老鼠分成两组。皮下注射研究药物和吗啡后，进行了另一个实验。例如，研究药物为四氢巴马汀（80 mg/kg体重），剂量在第21天逐渐增加至200 mg/kg体重，吗啡从35 mg/kg体重增加至53 mg/kg体重...体重。从向四氢巴马汀组注射53 mg/kg体重的吗啡后的第22天起，动物表现出兴奋和垂直尾巴，表现出类似吗啡的作用。向吗啡组注射200 mg/kg体重的四氢巴马汀后，动物表现出严重的中枢压迫感，四肢放松，将动物放在休息的笼子里。该作用的性质类似于四氢巴马汀。 （2）模型特征小鼠的尾巴反应与麻醉性镇痛药的成瘾平行。海洛因和吗啡等成瘾性强的药物的尾巴勃起指数大，可待因等成瘾性较弱的药物的尾巴勃起指数小。诸如吗啡吗啡的拮抗剂不会使尾巴直立，并且可以拮抗吗啡的直立尾巴反应。这是快速识别药物的简便方法。

　　2.鼠标跳跃实验（jumptestinmice）

　　（1）实验方法使用20-25g雄性小鼠，每组10只。吗啡每12小时皮下注射一次，剂量为100 mg/kg体重，共14次。上次注射吗啡后6小时即可上瘾。皮下注射纳洛酮剂量为5 mg/kg体重会引起中毒，将小鼠立即放在高35 cm，直径30 cm的桌子上，观察到纳洛酮注射后30分钟内跳跃的动物数量。然后每1.5、3或5小时观察并记录一次。纳洛酮注射后30分钟内戒断症状*严重。此外，观察到小鼠的体重显着下降，直肠温度降低（90-180分钟），自发活动和对抗增加。 （2）模型特征该方法基于以下事实：纳洛酮可诱导小鼠跳跃，以评估其对镇痛药的依赖性。纳洛酮诱导的小鼠跳动是研究吗啡戒断的敏感指标，但这不是依赖吗啡等止痛药的独特现象，可以被其他药物抑制。由于纳洛酮的作用时间短，因此应在纳洛酮注射后30分钟内观察到戒断症状。还可能确定触发跳跃的纳洛酮有效剂量（ED50）的一半，并且ED50值可用于确定研究药物的物理依赖性。该方法可用于筛选止痛药的物理依赖性。它的优点是经济，简单和速度快，指标清晰，灵敏度高。 3.2大鼠的大鼠大鼠在成为吗啡依赖性后用阿片受体拮抗剂治疗。在几分钟之内，动物表现出眼泪，流涎，腹泻，牙齿紧握，剧烈躁动和姿势异常。戒断症状和体重逐渐减轻。给予拮抗剂约2小时后，戒断症状基本消失，体重不再继续减轻。 （1）实验方法健康大鼠，体重200-220g，每组10只动物，雄性一半，雌性一半。他们被随机分为阴性对照组，阳性药物对照组和测试药物组。吗啡依赖性模型是通过剂量递增方法形成的，通常使用一个星期或两个周期的测试模型。吗啡以0.1 ml/kg体重皮下注射3次/天，剂量分别为5、10 mg/kg体重4天和15、20 mg/kg体重3天。第15天上午8:00，在*后一次服用阿片受体拮抗剂后40分钟皮下注射吗啡以促进戒断。纳洛酮的通常剂量是4 mg/kg体重。立即将大鼠放在透明的有机玻璃容器中，在1小时内观察并记录大鼠的戒断症状，在30分钟和60分钟内称重大鼠并记录戒断症状。还可以在2天内多次服用吗啡，然后注射纳洛酮，然后使用快速成瘾的方法鼓励戒断。

　　（2）大鼠冲动试验戒断症状评分

　　1）行为表现

　　异常姿势：2分

　　剧烈搅拌，触摸：1分；进近：2分

　　牙齿间歇：0.5分；连续性：1分2）自主神经系统症状

　　流量4分

　　腹泻和稀便：4分;不规则：8分

　　唾液分泌是轻度的：1分;明显的：2分

　　3.3建立模型的猴子是与自然退出实验相同。对于皮下给药，起始剂量为每6小时3 mg/kg体重，剂量可以逐渐增加并持续15或30天。在*后一次注射吗啡后两小时，根据猴子戒断症状分类标准皮下注射纳洛酮0.1 mg/kg体重或烯丙基吗啡1.0mg/kg体重，并在2小时内观察并记录动物戒断症状。去做。找到每组猴子的平均戒断分数和体重减轻率。一般来说，戒断症状的严重程度与吗啡给药的持续时间有关。从对猴子给药测试药物和标准药物的时间到促进戒断症状所需的阿片类药物拮抗剂的剂量，可以确定测试药物引起身体依赖性的性质和潜力。将根据上述吗啡猴冲动戒断试验程序对新药进行测试，以提供有关药物物理依赖性的信息。结合其他测试的结果，您可以预测潜在的身体依赖性。

　　4Substitutiontest（substitutiontest）

　　替代测试是研究药物抑制阿片类药物戒断症状的能力。通过比较具有不同依赖性的药物抑制戒断的能力，它为试验药物与吗啡类似的物理依赖性提供了实验基础。 4.1小鼠替代测试（小鼠）将健康小鼠随机分为几组，并使用上述自发戒断方法建立吗啡依赖性模型。停用吗啡后，给不同组的小鼠服用吗啡，L-美沙酮，哌替啶（甲哌丁啶），二氢吗啡和其他镇痛药和研究药物，与上述麻醉镇痛药相比，该研究药物被撤回，具有抑制反应的能力。被确定。受试药物的物理依赖性类似于吗啡。 4.2大鼠替代测试（大鼠）以上描述的各种技术可用于建立吗啡依赖性大鼠实验模型。吗啡戒断后，代替吗啡使用研究药物（也可使用小鼠实验方法，使用吗啡，L-美沙酮，哌替啶，二氢吗啡等镇痛药和研究药物），戒断研究定量观察根据设计的戒断评分标准，被测药物抑制戒断的程度。

　　4.3猴子替代测试（猴子）

　　猴子替代测试是评估研究药物是否具有吗啡样作用的*常用方法。吗啡每天两次经皮下注射入猴子体内，*天体重为9 mg/kg，第14天体重为53 mg/kg体重逐渐增加，并保持该剂量。给药后14到21天（总剂量约为497-631 mg/kg体重），猴子会被吗啡中毒。在每天注射吗啡之前，经常会感到烦躁不安。随着实验者的接近，前肢会自动伸展，使实验者可以给药，然后在给药后自由移动。*后一次注射吗啡后16个小时停止使用该药物，并以2.8-7.9 mg/kg体重皮下注射烯丙基吗啡进行中毒研究。给药后几分钟，猴子出现退缩症状，*初出现震颤和恶心，然后躺在地板上滚动并发出啸叫声。这在10到20分钟内*明显。此时，皮下注射受试药物（相当于吗啡），观察是否可以代替吗啡来解决戒断症状。所有替代方法均表明止痛药也具有成瘾性，并且与吗啡属于同一类型的麻醉作用。否则，它不属于此类型。例如，在替代实验中，四氢巴马汀减弱了吗啡戒断症状，并且未观察到继续产生戒断症状，从而导致猴子出现严重的呼吸困难和死亡。如果置换无效，将注射吗啡，在3-5分钟内，戒断症状将显着减轻或完全消除，恢复原状并自由活动。

　　5其他withdrawaltest

　　5.1 Bodyshakingtestinrats

　　（1）实验方法重达300-350 g的雄性大鼠。麻醉后，将导管放置在颈静脉的颈项中，并通过活塞连接到室外注射系统。在整个实验过程中将动物关在笼子里。吗啡溶解在无菌盐水中，并逐步给药至少5天。在第1天，每小时注射1.5 mg/kg体重的吗啡作为24小时维持剂量。每天增加剂量，并在第5天每4小时注射15毫克/千克体重的吗啡。从第6天开始，每6小时注射维持剂量的吗啡15 mg/kg体重，此时在每个注射间隔内大鼠均出现明显的震颤反应。注射吗啡15 mg/kg体重可以消除该反应。这种摇摆反应是戒断症状的可靠指标，因为可以在所有大鼠中反复观察到它。吗啡注射后六小时，可使用30分钟的观察来计数身体晃动。在对照组中，以相同的方式观察有或没有注射盐水的摇床的数量。另一个吗啡对照组（静脉注射后30分钟计数为15 mg/kg体重）观察到了其作用。

　　（2）模型特征身体摇摆是大鼠吗啡戒断的特征，当掉下的狗着陆并甩干水时，其头部和身体的摇摆类似。抖动现象如下。摇曳的身体像湿a的狗。当大鼠变得吗啡依赖性时，大脑中的多巴胺受体变得过敏，锥体束外神经递质的功能失衡，导致身体颤抖。由于该现象与吗啡戒断症状有一定关系，因此已被用作观察吗啡成瘾测试的指标之一。应该注意的是，身体震颤反应只是吗啡戒断症状的平行指标，而不是特定的作用。由于DA受体激动剂和拮抗剂会影响大脑中的DA受体过度活跃，因此应排除实验中可能出现的假阳性或假阴性。

　　5.2 AttackTestInTats

　　（1）实验方法：雄性大鼠，体重250-300 g。吗啡按照规定增加剂量，每天腹膜内注射3次，*天每天15 mg/kg体重，此后每天15 mg/kg体重。在第9天，体重为405mg/kg体重，此时每次注射吗啡为135mg/kg体重，并且在维持剂量3-5天后，停止注射吗啡。两个小时后，大鼠表现出戒断症状，例如体重减轻，身体震颤，眼睑下垂和扭动。这时，如果老鼠一起生活在同一个笼子里，它们就会互相攻击。挑战实验通常在*后一次注射吗啡后3天进行。将四只老鼠放在同一笼子里，观察一小时，并记录战斗经过的次数（即，前肢在空中接触，头部彼此面对，而后肢在战斗中站立）。互相攻击和咬人。

　　（2）模型特征：积极反应也是成瘾实验的观察指标之一。该实验实际上反映了吗啡中毒引起的大脑多巴胺能神经系统功能的变化。停药后出现的停药症状是高多巴胺能活动的症状，激动剂可能会增强发作反应，而拮抗剂可能会削弱发作效果。因此，为了将侵略性测试用作戒断症状的指标，还必须消除由于药物干扰多巴胺功能系统而引起的假阳性或假阴性。癫痫症状的时程与其他戒断症状不完全匹配。吗啡戒断后，*后一次给药后24小时出现自主神经和身体症状，而症状强度在72小时显着降低。*后一剂后24小时的侵略性不是很明显，并且在72小时时*明显。即使将其他戒断症状降低到*低水平，癫痫发作也非常强烈，甚至在*后一次服药后30天，癫痫发作也非常强烈。因此，应在停止注射吗啡后72小时进行观察。