动物造模,视网膜缺血大鼠模型 中国实验动物信息网 2021-12-29 1522

　　背景：缺血被认为是各种眼部疾病的主要致病性疾病，例如糖尿病性视网膜病，视网膜动脉/静脉闭塞和青光眼。缺血导致细胞凋亡，并通过激活神经胶质细胞增加某些神经毒性介质的产生。缺血性损伤后炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNFα）升高。在炎症，感染和创伤反应后，其分泌增加。 TNF-α结合受体并通过各种细胞内信号事件诱导神经元凋亡。先前的研究表明，在体外和体内缺血模型中，TNF-α的产生增加。玻璃体内注射TNF-α抗体后，肿瘤坏死因子α可通过中和作用显着保留视网膜功能。 Etanercept（Enbrel）是一种TNF-α抑制剂，可作为诱骗受体与肿瘤坏死因子-α结合。它是目前市场上用于临床的首个针对肿瘤坏死因子α的融合单克隆抗体。 Etanercept降低TNF-α的炎性作用，并用于各种自身免疫性疾病的临床治疗，例如类风湿性关节炎，强直性脊柱炎和银屑病关节炎。此外，*近的研究表明，全身注射依那西普可以有效预防青光眼大鼠视网膜神经节细胞的丢失。在青光眼和葡萄膜大鼠模型中可以检测到高水平的TNF-α及其化合物。受体。在这项研究中，广泛使用的TNF-α抑制剂依那西普在急性缺血性损伤后皮下注射，以确定其在预防轴突缺血性损伤中的有效性。这项研究的目的是确定依那西普是否可以减轻急性高血压视网膜缺血大鼠模型中的视神经变性和小胶质细胞活化。视网膜缺血动物模型：实验中使用了36只体重为250-300克的雄性SD大鼠。将所有动物在21°C下放置12小时的明暗循环。可以免费获得食物和水的恒温疗法设施和动物测试设施。在诱导局部缺血之前，通过腹膜内注射30 mg/kg噻环素（Salta；维克，沃思堡，德克萨斯州）和10 mg/kg甲苯噻嗪（Lombon 2％； Bayer，Peoria，IL）麻醉大鼠。它通过增加眼内压（IOP）诱导局部缺血，从而阻断了从视网膜动脉到视网膜的血液供应。将右眼的前房套管连接到带有30号针头和压力表的硅橡胶管，以进行0.9％的无菌生理盐水输注。当盐水容器升高到高于全身的动脉压时，眼内压升高。眼压为130mmHg，持续60分钟。虹膜白化病消失和视网膜红反射证实了视网膜缺血。对于视网膜灌注，每5分钟监测一次眼内压。然后停止注射，以允许视网膜血管的再灌注，这由复制的红色反射所证实。作为非缺血性对照，左眼用30针穿过对侧角膜插入前房。在不同时间处死动物，并移开它们的眼睛以进行形态学和免疫组织化学研究。 Etanercept治疗：将Etanercept与无菌水（0.3或1 mg/kg）混合，将大鼠分为3组。急性缺血或假注射诱导后一天，直到当天，第1组和第2组每周皮下注射0.3毫克/千克（N = 6）和1毫克/千克（N = 15）的依那西普。第二组用1mg/kg的依那西普治疗，治疗3天后处死3只动物，治疗2周后处死6只动物，治疗4周后处死6只动物。以相同的方式向第三组（n = 15）注射相同量的1 mg/kg磷酸盐缓冲盐水（PBS）。处理3天后处死3只动物，处理2周后处死6只动物。治疗4周后处死6只动物。剂量选择基于先前的研究，该研究显示了该药物在其他疾病模型中的功效。

　　组织学评估和免疫组织化学：在麻醉下移开眼球。*大限度地减少提取过程中的拉伸损伤。通过结膜外侧切口和侧截头肌切开术解剖视神经眶。当对会阴部进行足够的可视化以获取足够的神经长度时，将视神经从根部切开约3 mm，然后从眼球上移开。所得的轴突用Karnovsky的固定剂固定，用1％的渗透酸染色，然后包埋在常规石蜡中。 10μm连续切片。在4°C，将近视神经的短部分在2.5％戊二醛，4％多聚甲醛和0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中固定24小时。然后添加1％的overnight酸过夜，并在室温下用缓冲液冲洗。然后通过逐渐的酒精系列将组织脱水并包埋在环氧树脂中。用1％甲苯胺蓝和1％硼酸钠对视神经的横截面（1μm）染色，并测量横截面面积。创建了超薄（60m）横截面，并用透射电子显微镜（TEM）进行了观察。诱导缺血性损伤3天后获得的视神经用于小胶质细胞活性的免疫组织化学评价。将连接的视神经视网膜切片（10毫米）与含有10％山羊血清，0.5％明胶，3％牛血清白蛋白和0.2％Tween 20的PBS预孵育，然后与抗iba1兔抗体孵育（1：500）。做过。 ）作为小胶质细胞的标记。

　　视神经轴突损伤的定量：本研究的前提是视神经轴突的横截面为圆形或椭圆形。退化的轴突失去圆度，必须偏离其正常大小范围。轴突变性的特征在于轴突肿胀并分成髓磷脂层（密集的轴突），在严重受伤的病例中髓磷脂的破坏和广泛的纤维化。文献中报道的其他方法用于量化视神经轴突损伤。 Western印迹分析：在诱导急性缺血性损伤后3天，用小胶质标记物Iba1和CD68进行Western印迹分析。等量的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。分离出的蛋白质被电转移到PVDF膜上。用5％脱脂奶粉封闭后，将膜与抗Iba1和CD68抗体孵育过夜。将膜孵育1小时，并在室温下与针对兔IgG的HRP标记的二抗孵育（1：2000）。通过添加化学发光剂并将其暴露于X射线胶片来观察免疫应答区。

　　结果：Etanercept减少了轴突的病理变化：通过在透射电子显微镜下比较轴突的形态和视神经密度。急性缺血诱导后四周，实验组的视神经轴突损伤比对照组更大。该疾病的特征在于轴突肿胀和髓鞘鞘分离，轴突尺寸和形状的变化增加以及轴突密度降低。然而，与对照组相似，用1 mg/kg依那西普治疗后的轴突维持其正常组成和密度达4周。 1 mg/kg依那西普治疗组和PBS对照组治疗2周的动物眼球中保守轴突的比例分别为0.88±0.16和0.68±0.17。 1 mg/kg依那西普治疗组和PBS对照组治疗4周的动物眼球中保守轴突的比例分别为0.98±0.04和0.65±0.11、还显示了用0.3 mg/kg依那西普连续治疗4周。轴突保护比PBS组更好。 Etanercept减少小胶质细胞的活化：急性缺血诱导后3天，使用1 mg/kg etanercept治疗组的兔抗Iba1抗体免疫组织化学染色导致视盘小胶质细胞明显低于对照组。在对眼睛没有缺血性损伤的对照组中，视神经中出现少量Iba1和CD68阳性细胞。在眼缺血组中，相应的Iba1和CD68蛋白条带的平均分子量为17 kDa和75-110 kDa。但是，依那西普1 mg/kg治疗组眼中Iba1和CD68标记物的表达水平明显低于对照组。因此，依那西普治疗缺血性损伤后似乎可以明显阻止Ibal和CD68的表达增加。讨论：Etanercept是可商购的TNF-α抑制剂。这项研究证实了其在视网膜缺血大鼠模型中维持轴突结构和减少小胶质细胞活化的有效性。先前的研究表明，依那西普可以减轻大鼠葡萄膜炎模型的眼内炎症，并降低TNF-α的水平，从而预防青光眼大鼠视网膜神经节细胞的丢失。在这项研究中，诱导急性缺血3天后，使用小胶质细胞标记物证实了小胶质细胞激活的发展。oh等。报道青光眼模型大鼠眼内压升高后3天内肿瘤坏死因子-α水平升高与7天内相关小胶质细胞活化有关。因此，我们评估了缺血性损伤后3天的小胶质细胞活化，并阐明了由小胶质细胞引起的炎症反应。在这项研究中使用了两种小胶质细胞标记物Iba1和CD68。 Iba1提供了静态和激活的小胶质细胞和小胶质细胞密度的指标，而溶酶体抗原CD68可测量小胶质细胞的吞噬活性。这项研究有一些局限性。首先，我们没有直接评估视网膜神经节细胞的损失或TNF-α的水平结论：非处方的TNF-α抑制剂依那西普对大鼠急性心肌缺血后的轴突损伤具有重要意义，具有保护作用。关于依那西普的神经保护作用的其他研究将有助于确定该药物是否适合神经系统疾病的新疗法。