动物造模,eNOS基因敲除 中国实验动物信息网 2021-05-07 2282

　　高血压是一种复杂的多基因疾病，以动脉血压升高为特征，是冠心病，心肌梗塞和中风的主要危险因素之一、发病率和死亡率逐年增加，对人类构成严重威胁。  高血压的发展与血管收缩剂的分泌或活性增加以及血管扩张剂的分泌或活性降低有关。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在调节血压中起重要作用。血管内皮细胞产生一氧化氮（N0），其作用于血管平滑肌细胞，引起血管舒张并*终降低血压。 eNOS基因敲除大鼠模型的建立可以为高血压病因和治疗研究奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1动物

　　SPF级SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（Kyo）2012.0001]。所有实验小鼠均在中国医科大学实验动物科学系[SYXK（？）2013.0001]中以24±2°C的温度和50％±10％的相对湿度饲养。自动调光（亮12小时，暗12小时）[SYXK（辽）2013-0007]。

　　1.2eOS基因敲除大鼠的制备

　　1.2.1可注射基因的纯化使用锌指核酸酶（ZFN）技术，构建敲除载体，用限制酶消化，并与Ambion's gate SSAGEm MACHINE一起使用。 T7ULTRA试剂盒在体外转录，并通过Qiagennesay Mini试剂盒纯化。

　　将纯化的片段溶解在水中，并储存在-80°C下。注射前稀释，注射浓度为10ng /？TL。 1.2.2在大鼠PMSG25IU /小鼠腹膜内注射中，排卵和受体准备过多，在46“-？48小时后，hCG25IU /小鼠腹膜内注射，并且由正常SD雄性大鼠在相同的5周龄SD大鼠中进行第1天：在一个笼子中交配，第二天早晨检查阴道栓，然后将妊娠栓作为供体鼠检查，野生型，同时将笼子过度排卵，选择SD雌性小鼠并与结扎的SD雄性小鼠交配第二天早晨，将阴道移到阴道上，与舒安的怀孕小鼠见安安

　　1.2.3受精卵通过颈脱位收集并处死供体雌性大鼠，收集法罗皮乌斯氏试管并置于预热的M2培养基中，将肿胀的区域撕开。 1mg/mL，用透明质酸酶处理后，得到1个受精卵，用M2洗涤3-5次后，记录受精卵的量，转移至过夜培养。

　　1.2.4显微注射将编码eNOS特异性锌指酶的mRNA的体外转录和纯化注射到受精的大鼠卵中，将卵转移到COz培养箱中并进行温育。排卵前30分钟。转移。

　　1.2.5通过腹膜内注射胚胎移植麻醉0.1 g/mL含0.31 mL/100 g SD假孕大鼠。进行酒精消毒然后截肢。将其切开。肾脏，在法罗皮乌斯小运河的小角附近切开嘴，将输卵管从切口处插入法罗比安运河，将受精卵吹入安瓿中，静置一会儿再拉

　　1.2、检测6只大鼠10至15天大的年轻大鼠的尾巴组织，并在55°C的水浴振荡器中消化。在蛋白酶K的作用下，通过酚-氯仿法提取大鼠。 5'-TGTGTTCTCTTCTGGCTCAGG-3'，反向引物：5'-CAAAGATCcTrCCACGAAC。条件如下：94°C预变性5分钟，94°C 45S，60°C 45S，72℃45S，34个循环，*后延长在72℃下10分钟首席。对PCR产物进行测序并通过TA克隆以确认基因缺失。 1.2.7纯合子筛选将原代阳性小鼠和野生SD大鼠交配以产生F1杂合大鼠，将F1杂合大鼠彼此交配并选择纯合大鼠。

　　1.3 Western blot检测

　　eNOS取基因敲除大鼠心脏，迅速置于SD野生型大鼠中，将肾脏组织，液氮，组织压碎，用蛋白裂解物裂解，离心，共收集上清液，这是一种蛋白质。经过蛋白质定量，变性，SDS PAGE凝胶电泳，转移膜，脱脂牛奶放置并用抗体孵育，一抗为Immunoway Company抗体，二抗为山羊抗兔抗体。使用ECL化学发光试剂进行成像后，检测到eNOS的表达。同时，GAPDH用作内部控制。

　　1.4 4用eNOS基因敲除的纯合大鼠的外观和表型的观察目视检查纯合大鼠和同窝野生型大鼠的头，躯干，四肢，尾巴等，以观察是否存在异常。 。

　　1.5组织学和形态学观察

　　处死大鼠后，收集心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏，肌肉和腹主动脉的血管组织，并用0.25 g/mL多聚甲醛固定。将其包埋在石蜡中，切片并染色。苏木精-曙红（HE）用于通过光学显微镜观察和拍照组织结构和形态的变化。  1.6体重比较选择野生型SD大鼠的5只雄性和5只雄性，以及eNOS基因敲除大鼠的5只雄性和5只雄性。体重在8到16周大时比较。  1.7测量心率，血压，收缩压，舒张压5只雄性和5只雄性野生SD大鼠（8-9周龄）和5只雄性和5只雄性IVD，选择一只敲除大鼠。使用Softron BP-2010A设备，通过尾套法测量大鼠心率，血压，收缩压和舒张压。测量每只大鼠3次，并将平均值记录为大鼠的心率。血压，收缩压和舒张压。

　　1.8统计分析

　　数据表示为平均值±标准偏差±。在t检验组之间的差异，并且P\u003c0.05被认为具有统计学显着性。 结果2  2.1 eNOS基因敲除纯合大鼠基因型测试结果在体外转录和纯化eNOS基因基因敲除载体，并注入受精SD大鼠卵中。总共注射了441个受精卵，其中365个存活。移植十二只SD大鼠，以产生总共23只FO代大鼠。 PCR产物的测序和分析产生了总共4只阳性大鼠，其中选择了8号大鼠用于继代培养和纯合选择。在基因敲除阳性大鼠中，第四个外显子具有22个碱基的缺失，导致移码突变。  2.2蛋白质印迹检测使用 GAPDH作为内部参照，野生型SD大鼠在心脏和肾脏中表达eNOS蛋白，而eNOS基因敲除大鼠则表达eNOS蛋白。 2.3外观表型观察纯合eNOS基因敲除的大鼠表现出不同程度的肢体缺乏。

　　2.4病理学观察

　　野生型SD大鼠动脉内膜内皮细胞单层，表面光滑，但eNOS基因敲除大鼠动脉内膜内皮细胞肿胀，表面不均匀，外膜受损。 4） ..其他组织的形态结构无明显变化。实验动物与比较医学2015、35（4）

　　注：与同性野生型大鼠相比，P\u003c0.05、“ P\u003c0.01

　　3是生理，药理和行为研究，特别是讨论某些心血管疾病中的大鼠行为和神经学研究比小鼠更有意义和更理想的动物模型，大鼠在进化上比小鼠更接近人类并发炎，用于研究性和神经疾病。作为动物模型，其表型与人类临床表现相近，例如，在具有相同基因的阿尔茨海默氏病大型小鼠模型中，转基因大鼠的表型与小鼠的表型并不完全相同。该模型有效地重现了阿尔茨海默氏病的大脑病理变化，其表型类似于人类疾病的发展，更适合作为阿尔茨海默氏病的动物模型，大鼠的作用在生命科学研究中正变得越来越重要由于生理，行为和新陈代谢等方面的原因，某些人类疾病（例如高血压）非常出色，不能拥有新的小鼠模型，而必须依赖大鼠模型的建立，大鼠基因工程技术对于大型动物的发展非常重要。规模的小鼠模型由于受大鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养条件的限制，传统的基于大鼠ES细胞的基因靶向技术受到了极大的影响，并且独立于ES细胞基因的修饰技术更为出色。引入了ZFNs技术和TALENs技术[1O，CRISPCas9技术]等新的基因组编辑方法，开发了各种有效的研究工具，这些研究工具为研究基因功能提供了新的途径，这些技术的应用消除了这种需求。这项研究使用ZFN技术建立了一个eNOS基因敲除大鼠，该大鼠的第四个外显子缺乏22个碱基，导致了移码。大鼠蛋白质表达测试表明该基因未在肾脏和心脏中表达，免疫组织化学实验显示了相同的结果（未显示），达到了基因敲除的目的

　　eNOS的观察敲除大鼠在纯合子中有不同程度的肢体缺损淘汰赛大鼠。但是，发现杂合大鼠具有正常的外观。敲除大鼠的大小比野生型大鼠小。比较和分析了16周龄大鼠的体重。敲除大鼠的体重比野生型大鼠轻得多。这与先前对eNOS基因敲除小鼠的研究结果一致。雌性小鼠表现出减少的胚胎数量和高的静态出生率。敲除大鼠具有不同程度的肢体缺损，这也影响一些进食并影响身体。提高质量。 eNOS是调节血管功能的关键，并且在调节内皮细胞血管生成中也起着重要作用[14,15]。在这项研究中，大鼠动脉的HE染色表明，动脉的外观是明显的损伤，并且对血管功能具有恒定的影响。在敲除小鼠中发现了用于肢体发育的eNOS基因，未发现表型，在敲除大鼠中该表型明显。该基因对肢体发育的影响还需要进一步的研究。在eNOS基因敲除大鼠中，血压显着升高，收缩压和舒张压也显着升高。在人体的正常生理条件下，血管张力主要受血管收缩剂和松弛因子调节。作为体内重要的血管舒张药，NO与其他血管舒张药一起可以介导血管舒张反应，抵抗血管紧张素II和肾素等物质在体内的血管收缩作用。在大多数血管中，内皮依赖性舒张功能主要归因于源自eNOS的NO产物。 eNOS的下调可导致NO大量减少，并削弱血管的扩张功能。对eNOS基因敲除小鼠的研究表明，eNOS基因敲除小鼠的血压明显高于野生型小鼠，表明eNOS影响小鼠的血压水平。 Savard等。 ENOS基因转移可增强NO释放并预防高血压恶化。除了血压升高外，该研究还观察到基因敲除的雌性小鼠的心率显着降低，而雄性小鼠则没有。这可能是压力感受器反射机制对血压升高的反应。综上所述，本研究成功建立了可将eNOS基因敲除的大鼠，作为研究高血压病因的理想动物模型，同时为eNOS基因功能的研究奠定了基础。