骨桥蛋白,视网膜老化模型,动物造模 中国实验动物信息网 2022-01-27 1495

　　简介：骨桥蛋白（OPN）是一种由SPP1基因编码的分泌型糖基化磷蛋白。 OPN是一种结合细胞表面整合素和CD44突变体的细胞因子。整联蛋白在细胞内执行多种功能，影响细胞存活和凋亡，炎症，微矿化，细胞附着和迁移，细胞内信号转导，趋化性以及损伤后体内稳态的维持。损伤后神经元再生的调节。 OPN存在于神经系统，发育中的成年啮齿动物大脑和成年啮齿动物大脑中，嗅球，视网膜，纹状体和脑干中的神经元产生OPN。 OPN在生理条件下可能弱表达，但在炎症和神经退行性疾病中其表达可能增加。在视网膜中，OPN由视网膜神经节细胞（RGC）表达，该神经节细胞将视觉信号传输到大脑。GC对缺血和兴奋性毒性*敏感，可能有助于上调OPN表达并预防实验性青光眼。视网膜胶质细胞，星形胶质细胞，小胶质细胞和穆勒细胞维持视网膜稳态，提供结构支持，并影响新陈代谢，神经元吞噬作用，免疫反应和其他活动。反应性星形胶质细胞在各种类型的脑损伤后表达OPN，并与小胶质细胞有关，小胶质细胞起巨噬细胞的作用。星形胶质细胞提示，中枢神经系统损伤后激活的小胶质细胞会上调OPN，并可能在神经炎症的发病过程中发挥重要作用。 OPN与整联蛋白αVβ3受体结合。它可能是在缺血性损伤后胶质瘢痕形成过程中动员星形胶质细胞和小胶质细胞的趋化因子。实际上，OPN可能参与神经胶质细胞的活化，细胞修复，神经胶质和巨噬细胞的迁移以及反应性星形胶质细胞的基质重塑。基于此，OPN对视网膜星形胶质细胞和小胶质细胞的作用值得研究。此外，由于在穆勒细胞的分泌物中发现了OPN，因此我们研究了它们的形态，以了解OPN如何影响这些视网膜胶质细胞。衰老是神经退行性疾病的主要危险因素，OPN具有年龄依赖性的神经保护作用。正常视网膜衰老的一些变化包括RGC丧失，表达GFAP（神经胶质纤维酸性蛋白）的星形胶质细胞，细胞质细胞器增加以及小神经胶质细胞激活表型的获得。因此，重要的是要比较OPN丢失对年轻（3个月大）和年老（20个月）小鼠视网膜的影响。这项研究的目的是研究使用OPN敲除小鼠的OPN缺失对RGCS，星形胶质细胞，小胶质细胞和Muller细胞的影响。另外，衰老对OPN功能的影响是未知的，因此已经在各种年龄的动物中研究了该缺陷的影响。

　　方法：动物：雌性敲除动物（B6129S6（CG）-SPP1TM1BLH/J）和C57BL/6J小鼠，3个月大（n = 3野生型和n = 3敲除）和20个月大（n = 4野生型）在这些实验中，使用了n = 4个淘汰赛。动物可以自由进食和饮水，光暗周期为12/12、温度为21°C。组织收集：颈椎脱位后，处死动物并移开眼球。去除角膜，晶状体和玻璃体，并小心地提取视网膜。立即将在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备的4％多聚甲醛（PFA）固定在视网膜上5个小时，然后将其铺在滤纸上。移开眼睛并立即用4％PFA固定过夜以获取切片。然后将其冷冻并在4°C下于0.1M磷酸盐缓冲液中的30％蔗糖中储存24小时，并包埋在OCT中。冷冻切片（14μm厚）存储在-20°C下。免疫化学：如上所述，整个视网膜都被免疫染色。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤固定的视网膜，并在4℃下用PBS-TX-100-BSA（0.25％TrITO-X100和1％牛血清白蛋白）溶液摇动。整夜关闭。 ..然后将视网膜与相同抗体（用PBS-TX-100-BSA稀释）在4°C下孵育1天。抗RBPMS（具有多个剪接的RNA结合蛋白）豚鼠抗体（1：4000）检测RGC，抗GFAP小鼠抗体（1：1000）检测星形胶质细胞。然后将视网膜用PBS洗涤3次，每次15分钟，然后将其与用PBS-BSA（1％）1：1000稀释的二抗合并（Alexa Fluor 555结合山羊抗豚鼠抗体和Alexa Fluor 488结合山羊抗小鼠抗体）...用PBS冲洗视网膜3次，每次10分钟，将视网膜放在切片上，然后用PBS：甘油（1：1）固定玻片。如前所述，在切片上对小胶质细胞和穆勒细胞进行了免疫染色。将切片用PBS-TX-100洗涤两次，每次10分钟，然后与兔抗IBA1一抗（1：2000）孵育过夜，以检测小胶质细胞。使用兔抗谷氨酰胺合成酶抗体（1：10000）进行检测。多细胞。GC也用抗RBPMS豚鼠抗体标记。用PBS洗涤两次后，与二抗（Alexa Fluor 555或488山羊抗兔或抗豚鼠）混合1小时。将切片用PBS洗涤两次，每次10分钟，并将盖玻片用PBS∶甘油（1∶1）固定。

　　图像捕获：使用ZEN软件通过数码相机和荧光显微镜捕获图像。镶嵌区域由视网膜定义区域的重叠显微照片定义。一旦定义了镶嵌图，就可以测量视网膜的轮廓并计算出视网膜的表面积。 GC定量：使用ZESS软件对RGCS的数量进行半自动计数，并使用t检验比较野生型和OPN剔除视网膜的RGC密度。此外，Mann-Whitney U检验用于检验两组之间的差异。使用IBM SPSS统计软件V.21进行统计分析。星形胶质细胞形态：计算出星形胶质细胞占据的视网膜表面比例，并将其与视网膜中央（直径1 mm）的视神经的OPN基因敲除小鼠进行比较。上面星形胶质细胞的形态分支很复杂，妨碍了定量。结果：分别用RBPMS或GFAP抗体标记3和20个月大的野生型和OPN敲除小鼠的视网膜中的RGC和星形胶质细胞。 OPN基因敲除小鼠的视网膜有几个细胞密度非常低的区域。特别地，它位于距离视神经2.5mm的外围区域。在这些地区，随着年龄的增长，RGCS和星形胶质细胞的低密度进一步被夸大。评估整个视网膜和每个视网膜区域中RBP标记的RGC的数量，并计算其密度（RGCS/MM2）。 3个月大的野生型小鼠的平均RGC密度（2607.15±38.36gcs/mm2）高于OPN剔除小鼠的平均RGC密度（1953.37±29.75gcs/mm2），平均RGC密度为20-一个月大的小鼠是动物（野生），类型为2101.86±84.73gcs）/ MM2）。 20个月大的OPN基因敲除小鼠的平均RGC密度为832.77±114.28gcs/mm2、因此，OPN缺乏症在3个月时可使RGC密度平均降低25.09％，在20个月时进一步降低至60.7％。在野生型小鼠的视网膜中，星形胶质细胞覆盖整个视网膜，这是一个视网膜血管网络，以星形连接。相比之下，OPN基因敲除小鼠似乎具有较少的星形胶质细胞。星形胶质细胞数量少，分支短，过程低，提示星形胶质细胞萎缩。这种作用在20个月大的小鼠中比在3个月大的小鼠中更为严重，星形胶质细胞明显不足，并且某些细胞丧失了星形胶质细胞的形态。值得注意的是，OPN基因敲除小鼠的视网膜上有许多无星形胶质细胞的区域，且RGCS密度较低。 3个月大的野生型小鼠的星形细胞面积（33.05％±0.95）大于OPN敲除小鼠的面积（16.19％±3.47）。没有OPN，星形胶质细胞的密度降低了51.01％。在20个月大的小鼠中，野生型视网膜星形胶质细胞的比例（21.67％±1.02）仍高于OPN敲除小鼠的比例（9.14％±1.95），并且OPN的丧失可能会降低视网膜密度。确认的。星形胶质细胞。此外，在3个月大的OPN基因敲除小鼠中，两者之间的RGCS数量和星形胶质细胞覆盖面积与20个月大的野生型小鼠的参数非常相似。区别。年龄差异。在3或20个月时，在OPN剔除视网膜中未检测到小胶质细胞活化的迹象。在存在和不存在OPN的情况下，小胶质细胞的形态相似。此外，在所有情况下，小胶质细胞都位于视网膜内部。这意味着小胶质细胞不活跃，因为迁移到视网膜下空间是激活的迹象。*终，在野生型和OPN基因敲除小鼠之间的Muller细胞中，在3到20个月大的年龄之间没有发现差异。在这两种情况下，谷氨酰胺合成酶抗体标记的骨髓细胞都通过视网膜辐射，其过程围绕着视网膜神经元的细胞体。尽管20个月大的小鼠的视网膜形态可以改变，但穆勒细胞继续围绕RGCS细胞体和感光细胞。

　　结论：缺乏OPN可能导致过早老化。但是，小胶质细胞和穆勒细胞似乎不受OPN缺乏症的影响。因此，OPN可能是用于开发神经退行性疾病治疗方法的候选分子，在这种情况下，星形胶质细胞可能是特定的靶标。