动物造模,干眼模型 中国实验动物信息网 2021-12-27 3038

　　背景：干眼症（DE），也称为干燥性角膜结膜炎（KCS），是一种多因素的眼泪疾病，可引起不适，视力障碍，泪膜不稳定和眼表损伤，并伴有性行为。 KCS与泪层渗透压升高和眼表发炎有关。 DE的患病率在5％至35％之间，在女性中更为常见，并随着年龄的增长而增加。 DE的临床症状包括轻度不适，干燥，异物，眼疲劳，畏光，疼痛和其他症状，例如睁眼困难和视力差。对于复杂的发病机制，不同的动物模型可以模拟DE的不同病理生理机制。这些模型包括类似于SJ Sjogren综合征的遗传小鼠模型，诱导的泪腺炎症的大鼠模型，抗胆碱能药物以及通过睑板腺封闭术诱导的兔模型。兔眼便于裂隙灯显微镜检查，并且由于其性质温和且维护成本相对较低，因此适合进行研究。在家兔中建立KCS的常见方法是禁用泪腺并通过手术去除较硬的腺体和神经膜。在另一个实验中，使用50％的三氯乙酸烧伤兔眼球结膜，并通过手术切除泪腺，较硬的腺体和硝化膜。

　　方法：实验动物和伦理声明：15只新西兰雌兔，体重2.0-2.5公斤。在标准实验室条件（22±2°C，相对湿度60％±10％，明暗循环12小时）下饲养兔子。所有的兔子都可以自由进食和饮水。这项研究严格遵守关于在眼科和视觉研究中使用动物的科学声明。所有手术均在全身麻醉下进行，并肌内注射40 mg/kg盐酸氯胺酮，以*大程度地减少疼痛。 DE模型分组和归纳：将15只兔子随机分为3组。在A组（n = 5）中，手术切除了左泪腺，更硬的腺体和硝化膜。在B组（n = 5）中，使用50％的三氯乙酸灼伤左眼的结膜。在C组（n = 5）中，用50％三氯乙酸焚烧左眼结膜，并手术切除泪腺，哈德腺和硝化膜。右眼是正常对照组。用无菌盐水冲洗眼结膜表面，用碘前消毒手术眼周围区域，并在无菌条件下在手术室进行手术。滴入0.5％的盐酸普罗帕金滴眼液，在距眼睑边缘5 mm长和2 mm的左眼结膜上形成弯曲切口。钝性分离眶组织，切开was弓的边缘筋膜，并用弯曲的光滑镊子轻轻切开泪腺。去除的腺体具有完整的包膜，并且在体积和长度上相似。从内直肌和哈德腺体的前眶壁之间的底部切出硝化膜。通过隔膜切除术和胶囊将两者从切口移除。我们去除泪腺和较硬腺体的方法简单，微创且可行。保留泪腺和较硬的腺体用于常规病理检查。烧灼球结膜，将棉签浸入刚准备好的50％三氯乙酸中，作用于距角膜瓣环2-3 mm的左眼结膜5秒钟。立即用100 ml的0.9％无菌生理盐水冲洗结膜囊。手术前三天，每天应用3次含0.3％妥布霉素的眼药水。每天四次使用含0.3％妥布霉素和0.1％地塞米松的眼药水，并连续7天每天一次含0.3％妥布霉素和0.1％地塞米松的眼药水。所有外用药物都应用于双眼。在第56天，用过量的麻醉剂（氯丙嗪）杀死所有动物。测试：在建立模型后的第14、28、42和56天进行Schirmer I测试（SIT），角膜荧光素染色和结膜印迹细胞学检查。所有测试均由同一个人在相同的环境条件下使用标准技术进行。

　　泪液分泌试验（SIT）：在不麻醉的情况下，将Schirmer的试纸条插入结膜下囊，并紧闭双眼。 5分钟后记录湿长度（以毫米为单位）。在所有测试之后，将兔子固定在保持装置中并保持安静。 荧光素染色：注入一滴1％的荧光素溶液，并使用裂隙灯显微镜和钴蓝滤光片以16倍放大率观察所有动物的眼睛。根据描述的角膜荧光素染色的分级标准。角膜分为四个象限。每个象限中的染色强度范围为0到3（*高分是12）。下列准则用于评分：不进行角膜点状染色为0分，对于1-10点状染色为1分，对于11-30点状染色为2分，点状染色30分或对簇状染色为3分。分数1到4被定义为轻微，分数5到8被认为是中等，分数9到12被认为是严重。

　　结膜印迹细胞学：注射0.5％的盐酸普罗帕金滴眼液以擦去多余的眼泪，然后将0.45微米的硝酸纤维素滤纸轻轻放置在颞球结膜的2 mm角膜环的外表面。施加轻微压力5-10秒。然后取出滤纸，并立即放入新鲜制备的4％甲醛中至少30分钟。滤纸会因周期性的高碘酸变化而变色：（1）高碘酸氧化10分钟，（2）用自来水冲洗5分钟，（3）用蒸馏水冲洗一次，（4）用洋红色冲洗25分钟。染色，（5）还原焦亚硫酸钠5分钟，（6）用自来水冲洗5分钟，（7）苏木精染色5分钟，（8）1％盐酸-酒精的脱色30秒至1分钟，（ 9）用自来水冲洗5分钟，（10）用100％乙醇将95％的物质脱水1分钟，（11）用二甲苯清洗20分钟，（12）永久安装载玻片。用40倍显微镜观察细胞形态。所有样品将由同一个人进行评估。杯状细胞的不同部分的平均数量/ 10。表示为杯状细胞的密度。评估每只兔子的三个样品。光学显微镜：对动物实施安乐死后，从兔眼中取出5毫米宽的角膜和上结膜，并固定在10％甲醛溶液中。脱水后，将标本包埋在常规石蜡中，切片并用HE染色。在40倍显微镜下观察角膜和结膜的形态。在建立的DE模型中，还通过上述方法去除泪腺和较硬的腺体，并通过上述方法检查。

　　统计分析：数据结果基于平均标准偏差（SD）。使用SPSS16版本对数据进行统计分析。

　　结果：泪液分泌试验：术前左眼与正常对照组之间的湿润长度没有显着差异（P\→ 0.05）。在28天，42天和56天的研究中，AIT和B组的SIT显着低于术前测量。同样，C组SIT在所有时间点（14、28、42、56天）均显着低于手术前。但是，两组在28、42和56天的SIT差异不显着。在第28、42和56天，每组左眼的SIT显着低于对照组（右眼）的SIT。 C组的SIT也很低，只有14天。在第28、42和56天，C组左眼SIT明显低于B组左眼SIT。但是，在任何给定时间，A组和B组之间都没有显着差异。

　　角膜荧光染色：在基线进行裂隙灯测试，然后每14天再次检查一次。指出在所有三组中，手术眼睛的角膜荧光素染色均异常。在建立模型之前，没有一只眼睛有角膜点状染色，术前左眼和右眼得分没有显着差异。与基线相比，A组角膜荧光素染色在28、42和56天时显示出明显更高的评分。在B和C组中，荧光素染色评分在第14、28、42和56天高于基线。在第42天和第56天，左眼组之间的荧光素染色分数没有差异。与对侧对照组（右）的眼睛相比，A组的眼睛在术后28、42和56时具有较高的荧光素染色评分。 B组和C组的14天得分也显着高于对照组。术后14天，28天，42天和56天，A组得分显着低于C组得分，而B组在42天和56天显着低于C组得分。术后42天和56天，A组眼睛的荧光素染色评分也明显低于B组。因此，术后56天，A组（3.8±1.30），B组（7.4±±1.14）和C组（10.8±1.30）兔的角膜荧光素染色平均得分为轻至中度。