动物造模,慢性痛瘢痕动物模型 中国实验动物信息网 2021-10-11 1318

　　背景：四肢的持续性疼痛和手术后的背部疼痛可发展为慢性疼痛，这影响了许多患者的活动并导致生活质量下降。为了确定引起持续性疼痛的组织病理学和病理学机制，建立一个持续性疼痛性瘢痕动物模型，然后将其与模型周围组织和脊神经的疼痛相关联，并研究行为和病理变化。方法：大鼠广泛剥除其后爪的皮下组织以创建动物模型（瘢痕组），并在接下来的12周中检查与疼痛相关的行为。之后，进行疤痕组织染色，c-fos（L5背角）的免疫组织化学染色以及L5脊神经纤维/背根的电子显微镜分析。结果：同侧鞋底受伤的动物的机械性疼痛阈值降低了。维持这种状态12周。疤痕组织的胶原层中有许多成纤维细胞。发现在疤痕组和针孔后角L5水平侧组（假手术）之间，同侧神经元的c-Fos阳性区域无统计学差异。但是，在同一侧的L5的背根位置观察到了髓鞘神经纤维的切口。

　　结论：我们已经通过广泛破坏周围组织建立了持续性疼痛疤痕模型。已经观察到皮肤组织为纤维状和增稠的，这可以引起敏化并部分降解与疼痛的疤痕相关的脊神经。该模型使我们能够更好地了解由疼痛性疤痕引起的敏化机制，并探索人类治疗疼痛性疤痕的新方法。

　　简介：疤痕的形成是修复伤口和手术切口的必不可少的过程。据报道，疤痕组织中的难治性下腰痛综合征（FBS）与周围神经功能障碍有关。脊髓减压可减轻通常患有持续性下腰痛的患者的疼痛。在某些情况下，疼痛仍然存在，减压后的神经表明瘢痕部位的周围神经功能障碍会引起慢性疼痛。还观察到背部手术后的运动神经支配和肌肉萎缩，表明可能会发生感觉神经损伤。另一项研究报道，全髋关节置换术患者的慢性疼痛与术中神经损伤有关。由神经损伤引起的慢性疼痛的几种动物模型有助于了解神经性疼痛的机制。然而，由于缺乏特定的动物模型，目前尚无有用的方法可用于了解疤痕组织中慢性疼痛的基本机制。我们已经开发了一种疼痛性瘢痕的动物模型，该模型可用于在4周的亚急性阶段诱导可重复的和可量化的机械性痛觉过敏。这项研究的目的是使用这种动物模型来确定与疼痛相关的瘢痕组织的行为特征，并研究在12周的时间内形成的疼痛性瘢痕对脊神经和背角神经元的影响。在这项研究中，行为和免疫组织化学技术被用来检测与疼痛有关的行为随时间的变化，周围组织和脊髓神经的病理变化以及脊髓背角神经元的敏化。实验动物：使用26只重150g的雄性SD大鼠。这些动物被安置在带有柔软床上用品的塑料笼中，可以随意进食和饮水。大鼠在手术前至少5天适应环境，并分为两组（针孔和疤痕组）。手术：所有大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）。在疤痕组（n = 13、足部疼痛性疤痕）中，用18G针在左脚跟上开了一个针孔（针孔组）。通过将钢棒插入针孔并剥离皮下组织（= 3 mm）来创建疤痕组。在针孔组（左脚，N = 13假手术）中，使用左脚跟上的18G针产生针孔（图1）。任何动物的右侧都没有手术。行为测试：手术后，将大鼠放回原来的笼子，并在与手术前相同的条件下进行饲养。为了量化后爪的机械阈值，测量了后爪缩回对梯度机械刺激的响应。机械刺激使用VonFrey细丝。在测试过程中，将所有大鼠置于覆盖有透明塑料圆顶（8 * 8 * 18厘米）的金属网地板上，并用von Frey细丝对每只后爪的敏感区域进行机械刺激。使用时，每根灯丝都会有轻微的弯曲，在每种情况下确保有足够的力。在10秒内执行10次连续的Freyfilament操作，然后从*弱的强度开始逐渐进行一系列测试。观察到明显的戒断被认为是阳性反应，而*弱的阳性反应被认为是阈值。所有这些行为测试均在疤痕形成之前（第0天）进行，并且每周持续进行一次，直到术后12周。组织学和免疫组织化学分析的准备：手术后12周，用过量的异氟烷麻醉所有大鼠，并用4％多聚甲醛，0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.2灌注，收集包括脊髓和小腿在内的组织样品。取出的组织标本用0.1 M磷酸盐缓冲液4％低聚甲醛和pH 7.2重新固定。为了保持样品的形状，将组织浸入5％至20％的梯度蔗糖溶液中。立即将一半的脊髓和足部样品冷冻，并用设定为15微米厚度的低温恒温器切割所有样品。用TBST（含有0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水）洗涤3次后，将样品切片在封闭溶液（4％）中于室温孵育2小时。将切片用洗涤缓冲液（含有0.1％Tween 20的0.4％封闭剂）洗涤3次。然后在4°C下与抗c-Fos抗体（1：1000）孵育24小时。洗涤3次后，在室温下与山羊抗兔IgG抗体和Alexa Fluor 546孵育2小时（1：400）。*后，将洗液洗涤5次，加入含DAPI的ProLong？Gold Antifad试剂，并安装载玻片。疤痕和针孔组的所有6只大鼠均通过免疫组织化学染色。将每只动物的L5水平脊髓切成薄片。获得所有横截面图像后，评估c-fos阳性神经元。测量同侧或对侧疤痕或针孔meta指神经元的蛋白表达区域，在反卷积荧光显微镜下检查每个大鼠切片，并使用动态细胞计数软件进行图像分析。为了分析c-Fos-IR神经元，将脊髓的后角分为两部分：浅层（I-II层）和深层（III-V层）。

　　组织病理学：将脚埋入石蜡中并切成5-10微米厚的切片。连续切片所有组织，在左后肢底部形成的疤痕组织用苏木精-曙红（HE）和马森三色染色。瘢痕和针孔组中的五只大鼠进行了组织病理学检查。

　　电子显微分析：立即去除L5脊神经和背根神经节，并用剃须刀剁碎。脊髓神经先用2％戊二醛固定，然后再用1％OsO4固定。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对切片染色，并在显微镜下检查。 结果：疼痛相关的行为：冯·弗雷（von Frey）进行机械刺激，随着时间的推移产生的疼痛阈值如图所示。与术前对照值相比，在任何时候针孔组后爪或疤痕组后爪的相对侧都没有明显的阈值变化。但是，在瘢痕组中，术后5周，9周和10周，同侧后肢退缩阈值降低。此外，与同一只动物的另一侧相比，同一侧（治疗侧）在手术后1、2、3、4、5、6、7、8、10、11和12周的退出阈值明显很低比较针孔和疤痕组，我们发现同侧后爪和对侧后爪在手术后的所有时间点均具有较低的退出阈值。瘢痕类天疱疮的组织病理学检查：与针孔组相比，瘢痕组的真皮和表皮更厚，含有更多的胶原纤维。发现胶原纤维束的尺寸改变并且真皮与皮下区域之间的边界不清晰。在胶原纤维之间观察到许多具有圆形或椭圆形核的迁移细胞。与针孔组相比，瘢痕组在真皮和皮下层显示胶原纤维聚集。这些胶原纤维的取向是随机的。疤痕和针孔组中的五只大鼠显示出相似的组织学结果。脊髓背角的免疫组织化学检查：背角L5水平板I-II的同侧和对侧C-Fos-IR神经元区域的蛋白质表达没有统计学上的显着差异。针孔组。类似地，在这些组之间，在脊髓背角的L5水平，III-V层的同侧和对侧C-Fos-IR神经元区域的蛋白质表达也没有统计学上的显着差异。

　　神经纤维的电子显微镜分析：对照侧的神经纤维是正常的。没有观察到轴突或髓鞘变性。轴突的原生质膜与髓鞘紧密接触。相反，受伤的神经纤维显示出髓鞘的碎片，而雪旺氏鞘和轴突则完好无损。轴突质膜和髓鞘之间没有紧密接触。

　　讨论：皮肤疤痕被定义为“视觉上可见的皮肤结构，通过伤口愈合而干扰正常的结构和功能”。因此，瘢痕形成是皮肤结构异常，再生失败，而不是生物力学问题。疤痕也被认为是与慢性疼痛相关的因素之一。伤口愈合中P物质和降钙素基因相关肽（CGRP）密度的增加可能与伤口愈合的这些令人不快的感觉症状有关。开腹手术后患有慢性疼痛的人发现了与腹膜相连的P物质和降钙素基因相关肽。已经证实，同侧脊髓的后角具有对P物质和降钙素基因相关肽的调节。疤痕足的病理检查显示增生性疤痕被认为是痛苦的。已经开发了几种类型的慢性疼痛动物模型，并将其用于研究慢性疼痛机制的发展和维持。几种慢性疼痛模型，例如神经性疼痛，肌痛模型，关节痛和双侧脊髓关节痛模型，在先前的行为和免疫组织化学研究中均显示出痛觉过敏。在这项研究中，同侧后爪退缩阈值低于术前值。与相同时间点（包括同一侧和相反侧）的针孔组相比，瘢痕组的对侧退缩阈值降低了。

　　结论：手术后十二周，我们开发了一种疼痛的瘢痕形成和术后痛觉过敏的动物模型。这可能是由于持续性疼痛导致中枢神经系统可塑性改变的结果。我们的模型使我们能够更好地理解由疼痛性疤痕引起的敏化机制，并将在将来帮助我们研究治疗人类疼痛性疤痕的新方法。