动物造模 中国实验动物信息网 2022-03-25 951

　　目的： 构建特异性抑止大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中停止功用审定。

　　办法： 合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火构成的DNA双链定向克隆到穿越质粒pAdTrackCMV中取得pAdTrack-siRaf-1质粒,PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒停止同源重组取得pAd-siRaf-1质粒,后转染HEK293细胞,包装取得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒,继而感染原代培育的心肌细胞,经过Western blot办法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑止效率,液体闪烁计数仪测定3H-亮氨酸([3H]-leu)掺入率,用HJ2000图像剖析系统测定细胞外表积。

　　结果： 重组腺病毒载体经酶切、审定正确,制备的病毒感染效率高,携带Raf-1的病毒颗粒可以在蛋白程度有效抑止Ang Ⅱ诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞外表积及[3H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。

　　结论： 胜利构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染心肌细胞后能有效抑止Raf-1、NF-κB表达,抑止Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。